在细胞计数过程中，进行细胞活率分析是确保实验准确性和可靠性的重要步骤。简单的细胞计数只告诉我们样本中细胞的总数，而不能区分活细胞和死细胞。细胞活率分析不仅是细胞计数过程中的“质量守门员”，更是贯穿细胞实验全流程的核心质控环节。它通过量化细胞健康状态，为实验设计、数据解读、临床转化提供科学依据。忽视活率分析可能导致实验失败、资源浪费甚至临床风险。
常见的细胞活率分析方法包括台盼蓝染色法和AO/PI双荧光染色法，然而很多实验员缺乏对在这两种方法应用的认识，对于自己的样本，不能够及时采用合理的染色方法从而导致测试的数据，尤其细胞活率出现偏差影响后续实验。小薇今天就带大家重新认识一下这两种染色方法背后的故事，以及他们在细胞活率分析的应用区别。
台盼蓝（Trypan Blue)或称台盼兰、台酚蓝、台酚兰、锥虫蓝、曲利苯蓝，分子式：C34H24N6O14S4Na4 。台盼蓝是一种偶氮染料，其分子中含有共轭双键和芳香环结构，包括两个偶氮基，偶氮基能吸收一定波长的可见光，是一个发色团，这种共轭体系使得分子能够吸收特定波长的光，从而呈现颜色。偶氮染料是品种最多，应用最广的一类合成染料，并且随着偶氮基数目的增加，染料的颜色加深。
3,3'-{[3,3'-二甲基-(1,1'-二苯基)-4,4'-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)四钠盐
台盼蓝染色法是最早被广泛应用于细胞活率检测的一种经典方法，其发展历程反映了细胞生物学、细胞培养技术以及实验室检测方法不断革新的过程。在细胞培养技术刚刚兴起的早期，迫切需要一种简便的方法来区分活细胞与死细胞。基于细胞膜完整性与通透性的差异，科研人员发现某些染料（如台盼蓝）能够被完整细胞膜排除，而一旦细胞死亡、膜结构受损后，这些染料便可以进入细胞内部，从而为活细胞与死细胞的区分提供了依据。
台盼蓝作为一种水溶性染料，因其能在短时间内与失去膜完整性的细胞发生明显的染色反应，被逐步选用作为检测细胞活率的工具。最早期的应用主要依赖显微镜观察，将染色后的细胞悬液置于玻璃载片或血球计数板中，通过人工计数蓝染（死细胞）和不染色（活细胞）的细胞数量来计算存活率。
台盼蓝染色法的发展经历了从最初依赖人工显微观察到如今基于图像识别智能细胞计数仪应用的演变。这种染色方法不仅奠定了细胞活率检测的基础，也为后续更精细、更高通量的检测方法的发展提供了理论和实践基础。如今细胞活率检测方法日趋多样化，尤其AO/PI双荧光检测方法因其高灵敏度和高准确性的特点，被越来越多的科研人员所青睐，但台盼蓝染色法以其简便、直观和经济的特点，依然在日常细胞实验和初步活率评估中占有一席之地。
计数仪细胞台盼蓝染色（萌薇SmartCell 600摄）
荧光染料是能发出荧光的染料，是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。在吸收紫外线或可见光后，能把短波长的光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。
细胞活率分析中市面上存在多种荧光染色方法，其中AO/PI染色因其优异的性能和广泛的适用性，成为细胞计数仪活率分析最常见的方法。这种染色方式是利用两种染料：吖啶橙AO（Acridine Orange）和碘化丙啶PI（Propidium Iodide），对细胞进行快速、直观的进行染色活率区分。
AO是一种能与核酸结合的荧光染料，它的激发波长一般在470–500nm左右，发射波长约在520–540nm。由于它能够透过完整的细胞膜进入细胞内，对所有细胞（活细胞＋死细胞）均能染色，产生绿色荧光，因此在早期主要用于细胞结构的观察和核酸定量分析。在荧光显微技术兴起的过程中，AO逐步成为研究细胞核及核酸分布的重要工具，为后续的多染色技术打下基础。
PI是一种红色荧光染料，其激发波长通常在535–540 nm左右，发射波长在620nm左右。它的特点是不能通过完整的细胞膜，只能进入膜已受损的细胞。正因为这种选择性，PI在细胞死亡、凋亡或损伤细胞的检测中显示出独特优势，通过观察PI染色细胞来评估死细胞浓度。
细心的小伙伴会发现AO标记所有细胞（活细胞＋死细胞），而PI只进入死亡细胞，那么在荧光细胞计数仪中，它们是怎样将活细胞和死细胞分别染成单一的绿色和红色荧光。研究表明，一定浓度配比的AO/PI混合液中在某些情况下，当细胞死亡导致细胞膜破损后，AO和PI可能同时结合到同一DNA分子上。如果两种染料的结合位点彼此靠近，就可能发生发生荧光能量共振（FRET）现象。FRET可能导致AO的绿色荧光部分转移给PI，进而增强PI的红色荧光。这种能量转移现象会改变原本预期的荧光强度比例，进而影响活细胞与死细胞的区分。所以在荧光细胞计数仪中，在AO/PI混合液染色后，我们会把绿色荧光标记为活细胞，红色荧光标记为死细胞。
小鼠骨髓细胞AO/PI荧光染色（萌薇Find C 摄）
即使荧光染色方法的结果会更加精准，适用的细胞范围会更加广泛，但小薇观察到现在许多实验室在分析细胞活率时仍然采用台盼蓝染色方法，分析下来几点原因：
1、对于许多日常的细胞培养和传代工作，只需要获得一个大致的活率数据，以确保细胞状态良好，通过台盼蓝染色获得一个大致的活率。
2、几乎所有实验室都具备普通光学显微镜，加上台盼蓝染色的试剂成本低，这对于预算有限或条件较简单的实验室来说，无疑是一种经济高效的选择。许多实验室并不具备荧光显微镜，缺乏对荧光计数仪的了解，即使计划买计数仪，也是优先考虑台盼蓝的染色原理。
3、台盼蓝染色方法在细胞生物学领域应用已久，具有大量文献和实验经验作为支持。许多实验室在建立实验标准操作流程（SOP）时，往往会选择经过验证且历史悠久的台盼蓝染色作为基本手段，从而保证实验数据的一致性和稳定性。
然而这些原因并不能够掩盖台盼蓝自身的局限性，尤其在分析原代细胞以及活率比较低的细胞会出现模棱两可或者难以判断的结果，为什么会出现这些现象呢？
首先台盼蓝染不同的死细胞形态不一致，人工依赖操作者的主观识别，而计数仪对仪器的算法识别具有挑战性，死细胞识别不够准确，导致细胞活率不准确。对于不同培养时期的细胞，尤其是培养时间比较久，状态比较差的细胞，在显微镜下会观察到一些浅蓝色呈弥散状态的物体（红色箭头）。这种细胞被染成蓝色后迅速膨胀和破裂，细胞失去形态，当我们在显微镜下计数时，这些细胞可能因为颜色太浅通常不会被计在内，因而导致死细胞的漏数和存活率的高估。
研究人员通过实验分别用台盼蓝和AO/PI荧光染色分析不同活率状态的同种细胞，数据研究表明当细胞活率高于80%时，台盼蓝和荧光染料测得结果间的差距较小；而当活率低于80%时，两种方法测的结果间的差距会有显著差距，最高可达30%。因此小薇建议对于存活率低于80%的细胞样本应该用荧光染色法来分析细胞活率。
其次，台盼蓝染色难以区分杂质、颗粒等非核细胞的干扰。在原代细胞分离过程中，由于样本直接来源于组织或器官，有可能存在红细胞、组织碎片以及其他杂质的残留。这种情况比较常见，台盼蓝染色无法排除这些非核细胞和杂质的干扰，在分析活率的时候显得束手无措。AO/PI双荧光染色则利用自身和核酸特异性结合的特征，这种原理在分析细胞活率时，完全根据荧光的有无和荧光的颜色进行判断，结果一目了然。
磁珠和T细胞混合，荧光染色排除磁珠干扰（SmartCell 800摄）
最后，台盼蓝的使用浓度非标准化，尽管大多数实验和推荐使用的台盼蓝浓度为0.4%，0.4%的浓度并不是一个绝对标准，而是一个广泛适用的推荐值。于是小薇测试了国内外6款台盼蓝，对比发现标注的0.4%浓度台盼蓝颜色也是参差不齐。
但是在实际应用中，细胞计数仪又普遍采用0.2%的台盼蓝，这是为什么呢？人工计数通过显微镜直接观察细胞，较高的台盼蓝浓度（0.4%）能使死亡细胞染得更明显，活细胞则保持透明，从而便于操作人员用肉眼区分活细胞和死细胞。这种较高浓度有助于提高视觉对比度，使得人工判断更直观、明确。但是细胞计数仪依赖图像和识别算法，使用适中浓度（0.2%）的台盼蓝可以避免染料过浓导致背景噪音增多或者细胞边缘模糊，从而获得更清晰、标准化的图像数据，这也便于软件算法准确识别和计数。当然也有不少小伙伴采用0.4%浓度的台盼蓝应用在细胞计数仪中，这容易使得图像背景过于复杂，产生沉淀或非特异性染色现象，影响计数仪的识别准确性。而0.2%低浓度台盼蓝有助于降低背景干扰，保证图像中细胞与背景之间的信号差异更为明显，从而提高自动计数的准确性和重复性。所以在这里小薇建议大家，如果实验室是0.4%浓度的台盼蓝，可以先用PBS缓冲溶液稀释为0.2%浓度，再进行过滤使用效果更佳。还有一点很重要，台盼蓝正常室温保存即可，如果4℃保存，需要复温之后使用。
在实验室实际应用中，科研人员需要根据实验目的、样本数量、设备条件和经济预算等因素选择合适的方法。若实验室设备条件有限、实验规模较小或仅需快速评估细胞总数，则台盼蓝染色法因其操作简单、成本低廉而被广泛采用；而对于要求高精度数据，尤其对于复杂的原代细胞和状态差的细胞，AO/PI双荧光染色法则具有更大的优势。
此外，近年来随着自动化细胞计数仪的发展，荧光染色方法正逐步取代传统的台盼蓝法，成为细胞活率分析的新趋势。尽管AO/PI染色在设备投入和操作要求上更高，但其数据准确性和稳定性为细胞生物学、药物开发等领域提供了更为坚实的技术支持。这也是为什么在最近国家药监局食品药品审核查验中心发布《细胞治疗产品生产检查指南》中对于活细胞密度和细胞活率的检测方法明确指出采用荧光法。这是基于提高检测灵敏度、保证数据客观性、满足高通量、适应复杂细胞群体特性以及确保产品质量和安全性的需要。采用荧光检测方法，可以更准确、全面地反映细胞状态，从而为细胞治疗产品的研发、生产和监管提供坚实的数据支持和质量保证。
计数仪作为萌薇生物推向市场的首条产品线，以出色的性价比和优异的技术性能，在众多实验室和生物技术企业中得到了广泛认可和推广。从分体机到一体机，从明场台盼蓝染色到荧光染色，从低物镜放大到高物镜放大倍数，并结合先进的人工智能算法（AI算法），这不仅能够满足多领域、多应用场景的计数分析，可以对细胞浓度、活率等细胞参数进行准确检测；为客户提供符合FDA21 CFR Part 11要求的安全用户登录系统、多级用户管理权限及审计追踪，还可以为客户提供3Q验证服务和方法学验证，同时软件可通过CSV认证（计算机化系统认证），支持数据的备份与恢复；仪器具备CE认证（安全合格标志）和VHP（汽化过氧化氢）灭菌。
下面小薇带大家认识一下他们，相信总有一款适合您的需求！欢迎大家扫码试用！
明场分体机（连电脑）
非台盼蓝细胞计数
台盼蓝染色活率分析
人工智能算法
630万像素高清成像
6样品孔通量
8秒检测分析
明场一体机
非台盼蓝细胞计数
台盼蓝染色活率分析
人工智能算法
630万像素高清成像
6样品孔通量
8秒检测分析
明场＋双荧光一体机
AO/PI荧光分析
非台盼蓝细胞计数
台盼蓝活率分析
GFP/RFP转染分析
人工智能算法
630万像素高清成像
6样品孔通量
明场＋四荧光一体机
AO/PI/DAPI/CY5荧光分析
非台盼蓝细胞计数
台盼蓝活率分析
GFP/RFP转染分析
人工智能算法
630万像素高清成像
6样品孔通量
明场一体机
酵母、小球藻、菌种计数
寄生虫卵囊计数
血小板、免疫细胞计数
台盼蓝染色活率分析
人工智能算法
630万像素高清成像
6样品孔通量
20倍光学放大
明场＋双荧光一体机
酵母、小球藻、菌种计数
血小板、免疫细胞计数
双荧光活率分析
人工智能算法
630万像素高清成像
6样品孔通量
20倍光学放大
明场＋双荧光一体机
AO/PI荧光分析
台盼蓝染色分析
非台盼蓝细胞计数
GFP/RFP转染分析
人工智能算法
1200万像素高清成像
6样品孔通量
广州普洋仪器仪表有限公司网站内容再次更新